RNA治疗药物的纳米级递送平台：有效递送的障碍
在过去的几年里，RNA 纳米药物产生了巨大的临床影响，从 2018 年 FDA 批准脂质纳米颗粒(LNP) 包裹的 siRNA 治疗药物 Patisiran 开始，以及最近广泛使用的mRNA SARS-CoV- 2 疫苗mRNA-1273和 BNT162b2。虽然这些药物的批准可以看作是数十年来将 RNA 纳米疗法引入临床的努力的成果，但它也标志着更智能、更个性化的纳米药物新时代的开始，其源于靶向RNA 疗法所提供的多功能性和精确性水平。与受靶蛋白“成药性”限制的小分子疗法不同，RNA干扰 (RNAi) 疗法在蛋白质翻译水平发挥作用。这样，理论上讲，短干扰 RNA (siRNA) 可用于治疗任何可受益于蛋白质下调的疾病。同样，反义寡核苷酸 (ASO) 已在临床中用于促进 RNA 降解，例如inotersen，或操纵 RNA 剪接，例如 eteplirsen。目前尚不清楚哪种方式会导致患者的效力和耐受性更高；ASO及其治疗应用已在各种地方进行了广泛的审查。相反，基于mRNA 的疗法有可能通过表达治疗基因来治疗疾病。最后，随着基因编辑工具（如CRISPR/Cas9）的出现，有可能通过单一治疗提供长期的基因“治愈”。
尽管具有巨大的潜力，但将新型 RNA 疗法转化为临床应用的进展受到递送挑战的限制。核酸是较大的亲水性分子，不容易穿过细胞膜，因此它们向靶细胞的功能性递送通常取决于可以促进摄取和递送到细胞质的纳米级载体。虽然病毒性递送在某些情况下已被证实成功，但基于RNA 的疗法提供了许多潜在的优势，包括无插入诱变、无需穿过核膜，以及siRNA 和 mRNA 的瞬时性质，这对于许多应用来说是非常理想的。为了应对这一挑战，已开发出合成性纳米级载体，以促进siRNA 和 mRNA 有效递送至体内目标组织和靶细胞；目前临床使用的三种 RNA 纳米颗粒药物以及目前正在临床研究的大量 RNA 纳米药物突出了这种方法的成功（表 1）。
表1. 临床研究中的纳米颗粒介导的RNA疗法示例
在本文中，我们将介绍阻碍将 RNA 纳米治疗药物有效递送至体内靶细胞的许多障碍。然后，我们将提供已成功用于克服这些障碍的合成递送系统的例子；对此，我们将介绍一些对其设计和开发方式很重要的考虑因素。最后，我们将重点介绍目前处于临床前和临床开发阶段的一些有前途的、纳米颗粒介导的RNA 疗法，并重点关注最近的发展，特别是在体内治疗性基因编辑和mRNA 疫苗领域。
RNA疗法有效递送的障碍
RNA 疗法广泛应用的主要障碍是与安全有效的细胞内递送相关的挑战（图 1）。在本文中，我们将介绍这些障碍中的每一个，以及为克服这些障碍而开发的一些方法和材料。
外源性物质在循环过程中的降解和清除
由于 RNA 的自我切割能力和 RNase 的普遍存在，RNA本质上是“短命”的。事实上，研究已发现裸mRNA 在添加到人血浆中的几秒钟内几乎完全降解。对于siRNA，这种降解可以通过将化学修饰结合到糖磷酸骨架中而得以延迟。研究表明，在整个糖-磷酸骨架的特定位置上有或没有硫代磷酸键的情况下，在2’-糖位上修饰的siRNA，可以显著提高血清稳定性，但不会降低其沉默能力。这些化学修饰的结合使得能够使用无纳米颗粒的siRNA 递送系统，例如三触角 GalNac 偶联物，其中两个产品现已获得 FDA 批准。然而，虽然通过化学修饰实现血清稳定性可能是裸 siRNA 的可行递送方法，mRNA 似乎不太容易对其糖-磷酸骨架进行修饰。因此，纳米颗粒 (NP) 的封装对于 mRNA 的递送尤其重要，因为它可以提供针对内源性核酸酶的保护。
一旦进入循环，全身给药 NP 面临的主要障碍之一是肝窦内皮细胞 (LSEC) 和单核吞噬细胞系统 (MPS) 的清除。长期以来，MPS细胞的 NP 调理作用和随后的吞噬过程一直被认为是纳米载体药代动力学的主要因素，并且已被证明适用于多种递送材料。在许多情况下，这种脱靶摄取和清除会导致给药材料的显著损失。例如，研究表明，大量的siRNA 有效载荷在 LNP 给药后 30 min内被LSEC 和Kupffer细胞迅速内化，在接下来的几个小时内，肝细胞的摄取率要低得多。类似地，已证实在体内转染肝细胞的含有 DNA 或 mRNA的LNP被发现以与肝细胞相当的速率在 Kupffer 细胞和 LSEC 中积累并转染。
用于改善全身给药 RNA NP 药代动力学的最广泛使用的策略之一是用亲水性聚合物，如聚乙二醇 (PEG)，包被表面。这种表面包被既可以通过防止溶液中 NP 之间的聚集来提高胶体稳定性，又可以通过在 NP 和促进调理作用的血清蛋白之间提供空间屏障来抑制 MPS 细胞的摄取。然而，尽管PEG修饰可以显著改善RNA NP在单剂全身给药后的循环，但可导致MPS 细胞在随后的给药过程中快速摄取，这一过程称为加速血液清除(ABC)。例如，对于PEG修饰脂质体，在第一次给药后 1 周给药时，几乎有一半的二次注射剂量被肝脏的Kupffer细胞快速捕获；这与第一次剂量形成鲜明对比，后者有超过一半的注射剂量即使在注射后24 小时仍保留在循环中。已显示在含有mRNA的PEG修饰LNP中会发生相似的抗磷脂酰胆碱(PC) 和抗PEG IgM 依赖性过程的效应。有趣的是，这种效应被证明是高度时间依赖性的，每隔一周给药一次，随后的剂量不会显著降低蛋白质表达。此外，大部分人群中可能存在抗PEG 抗体；近期 mRNACOVID-19 疫苗的过敏反应报告强调了这一发现的意义，即这可能是由于存在预先存在的抗PEG 抗体。为了解决这些问题，已经提出了一些NP 聚乙二醇修饰的替代方案，例如用聚（恶唑啉）和两性离子聚合物包被的NP。
图1. 全身给药RNA疗法和体内功能性递送之间的屏障。
运输到目的细胞，同时避免脱靶摄取
除了逃避 MPS 和 LSEC 的细胞外，全身给药的NP必须分布到目标组织并进入靶细胞才能有效。这种细胞摄取过程可以通过NP 的被动或主动靶向来发生。由于 NP 的物理化学特性，例如通过与血液蛋白的自发结合和特定蛋白冠的形成，会被动靶向特定细胞类型。例如，使用含siRNA 的 LNP 在体内沉默因子 VII 被证明在很大程度上依赖于apoE 的存在，这表明将 apoE 掺入 LNP 蛋白冠对肝细胞靶向至关重要。同样，白蛋白的存在已被证明提高原代肝细胞对某些mRNA LNP 的摄取。NP 也可以因其物理特性的直接结果而在组织中积累。例如，静脉内给药的阳离子 DNA 脂质复合物将迅速在各种器官的内皮上形成簇，可能通过形成聚集体，然后可以保留在毛细血管床中。最后，可以通过增强渗透性和保留(EPR) 效应来促进肿瘤的被动靶向，或者由于异常、渗漏的脉管系统导致肿瘤中的物质积累，但这种效应的临床功效仍是一个持续争论的主题，因为由于它在大型动物模型和人类中并不一致。
另一方面，主动靶向依赖于与 NP 表面偶联的靶向配体来指导细胞特异性摄取。最近成功用于体内递送的靶向 NP 系统的例子包括用于卵巢肿瘤基因编辑的 EGFR 抗体偶联 LNP、用于特异性递送siRNA 至 M2 样肿瘤相关巨噬细胞的肽功能化 LNP，以及用于优先递送 siRNA 和mRNA 至 LSEC而不是肝细胞的甘露糖基化 LNP。尽管这些靶向递送系统在过去取得了一些成功，但有证据表明，在NP 上形成蛋白质冠可能会掩盖靶向配体的活性位点，从而降低其作用。吸附蛋白的这种筛选作用可能取决于NP 的物理化学性质和配体偶联化学。此外，用抗体修饰表面可能会产生意想不到的后果，例如通过Fc 受体介导的结合增加 LSEC 的脱靶捕获，增加补体蛋白的调理作用和随后的白细胞摄取，以及形成针对偶联抗体的抗药物抗体（ADA）的可能性。尽管使用抗体片段可能会解决其中一些问题，但这些问题突显了仔细设计主动靶向NP 的必要性。
内体逃逸、逃避先天免疫和递送后的稳定性
一旦被靶细胞内化，NP 将面临进入细胞质中的挑战，其 RNA 有效载荷可以在那里发挥作用。聚合物 NP 可以通过促进渗透膨胀并通过“质子海绵”效应导致内体破裂，或通过聚合物的质子化胺和内体膜的阴离子磷脂之间的直接相互作用使内体的区域局部不稳定来实现这一点。另一方面，人们普遍认为LNP 可以通过与内体膜融合形成反六角相来促进逃逸。对于聚合物和脂质NP，这种内体逃逸过程效率低下，因为内体循环率高且内体货物释放速度慢，大量研究表明，只有不到10% 的内化 RNA 到达细胞质而实现功能递送。
一旦释放到细胞质中，RNA 有效载荷必须避免被先天免疫系统检测到才能有效。外源性 siRNA 和 mRNA 本身具有免疫原性，因为它们会被模式识别受体(PRR) 识别，例如 Toll 样受体 (TLR) 和RIG-I，可诱导 I 型干扰素的表达，导致蛋白质产生减少，甚至细胞死亡。某些化学修饰，例如 LNA 碱基和对糖磷酸骨架的 2’ 修饰，已显示可降低siRNA 的免疫原性，但必须注意避免对功能产生负面影响。将化学修饰的核苷酸掺入mRNA 也可以减少 PRR 的识别，并且可能会增加蛋白质的产生量并实现长时间表达。mRNA 的 HPLC 纯化也已证明可通过去除双链(ds)RNA 污染物来降低免疫原性，并显著增加碱基修饰和未修饰mRNA 的蛋白质产量。然而，应该注意的是，一些动物研究表明，未修饰和修饰的mRNA，以及HPLC-纯化和硅胶纯化mRNA之间的蛋白质产量没有显著差异，表明这些影响可能取决于递送平台、特定 mRNA 序列和动物物种。最后，环状 RNA 构建体已被开发为有效的表达载体并通过去除末端基序来赋予核酸酶抗性，后者可能对PRR 的检测也很重要。研究表明，与未修饰的线性对应物相比，使用环状mRNA 可以显著降低先天免疫的激活并提高蛋白质产量。
与血清中的游离 siRNA 和 mRNA 一样，未包封的RNA 容易在转染细胞的各个隔室中降解。一项研究表明，在与HeLa 细胞提取物孵育 1 小时内，完整的未修饰 siRNA 的水平降低了大约一个数量级；然而，同一项研究表明，对糖-磷酸骨架进行化学修饰既可以提高稳定性又可以延长沉默。相似的，mRNA也会在递送后快速降解。一项使用 LNP 递送 Cas9 mRNA 和单导向(sg) RNA 的研究发现，递送的RNA在数小时内被大部分降解。与 siRNA 一样，可以将位点特异性结构修饰加入到mRNA 中以提高稳定性并延长表达。例子包括对3' 末端的化学修饰、将糖修饰的碱基掺入poly(A) 尾以及 mRNA 的环化。
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原文：L.H.Rhym,D.G.Anderson, Nanoscale delivery platforms for RNA therapeutics: Challenges andthe current state of the art. Med, 2022, 3(3): 167-187.
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